封闭类器官培养步骤通常涉及多个精细的环节，以下是基于基质胶法的一般性步骤，以供参考：

一、准备工作

仪器设备：准备CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅或水浴摇床、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊等仪器设备。

试剂耗材：根据所要培养的类器官类型准备相应的培养基、缓冲液、消化液、基质胶等试剂耗材。例如，人肠癌类器官培养所需的试剂耗材包括人肠癌类器官培养基试剂盒、基质胶（低因子、无酚红）、60mm细胞培养皿、100μm滤筛、15mL离心管、1.5mL EP管若干、24孔细胞培养板、金属冰盒等。

二、操作流程

样本准备：

将组织放入含有预冷（2~8℃）组织保存液的取样瓶中（浸没整个组织），4℃条件下从医院或实验室取回。

将取样瓶消毒后，取出组织放入培养皿中拍照，并登记大小、颜色、软硬程度、组织类型等信息。

清洗与剪碎：

在60mm细胞培养皿中用2~3mL原代培养缓冲液浸泡组织。

用原代培养缓冲液清洗三次（每次更换培养皿）后，将组织剪碎成大约1~3mm³的组织块，转移至15mL离心管中。

消化与过滤：

向15mL离心管中加入5倍体积的人肠癌原代组织消化液（消化液体积：组织体积=5:1），在37℃条件下进行消化15~30min（消化过程中随时观察消化情况）。

取少量液体在显微镜下观察，当镜下观察到较多的细胞团（5~50个细胞抱团）后，加入3倍体积的原代培养缓冲液终止消化，用枪头轻柔吹打使液体变浑浊。

使用100μm滤筛进行过滤，取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15mL离心管中，于300g、4℃条件下富集离心5min后移去上清。

加胶、点板与加液：

基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

将细胞团沉淀与基质胶混合均匀（不要产生气泡），然后进行点板操作。每孔加入25μL基质胶细胞团混合物至24孔细胞培养板中。

将铺好的培养板放入37℃培养箱中4060min成胶，然后添加500750μL类器官培养基进行培养。

三、后续培养与传代

培养观察：将培养板放入CO2培养箱中进行培养，并定期观察类器官的生长情况。

传代操作：当类器官达到一定大小（如直径在200μm~500μm）时，可进行传代操作。传代步骤包括收集、洗涤、消化、重悬、点板和加液等。

收集：移液器吸去培养基，每孔添加1~2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液，轻柔吹散基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组）。

洗涤与消化：加类器官传代培养缓冲液定容并静置或冷冻一定时间使基质胶软化，然后进行离心分离。接着添加类器官传代消化液进行消化，消化成细胞团后终止消化并再次离心。

重悬、点板与加液：将细胞团沉淀与基质胶混合均匀后进行点板操作，并添加类器官培养基进行培养。

需要注意的是，不同类型的类器官培养步骤可能略有差异，具体应根据实际情况进行调整和优化。同时，类器官培养过程中需要严格控制培养条件（如温度、pH值、氧气浓度、营养物质和生长因子等），以确保细胞的正常生长和分化。此外，还需要定期观察和分析类器官的形成和发展过程，以便及时发现问题并进行调整。