一、源自供体肠隐窝的培养方法

隐窝分离：

从成熟个体（如小鼠或人类）中分离出肠隐窝。这通常通过手术切除肠道组织或活检取材来实现。

将分离出的肠隐窝包埋在Matrigel基质胶中，以提供细胞生长所需的支撑。

培养基配制：

配制富含生长因子的培养基，这些生长因子通常包括Wnt3a、EGF、Noggin和gastrin等，它们对肠道类器官的生长和分化至关重要。

细胞培养：

将包埋在Matrigel中的肠隐窝放置在富含生长因子的培养基中进行培养。

经过7~10天的培养，逐渐形成一个肠道类器官结构，该结构包含多种肠道细胞类型，如肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞。

二、通过定向分化ESC或iPSCs构建肠道类器官

细胞来源：

使用胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSCs）作为起始细胞。

定向分化：

通过特定的分化方案，将ESC或iPSCs定向分化为中肠或后肠组织。

再逐步培养分化出所有主要的肠上皮细胞类型及肠干细胞，以模拟肠道发育过程。

培养基与生长因子：

在分化过程中，需要使用特定的培养基和生长因子来支持细胞的生长和分化。

三、hPSCs细胞来源的肠类器官培养方案

Matrigel准备：

将冻存的Matrigel在4°C下过夜解冻，并均匀滴加在培养板中。然后转移至37°C条件下孵育使其凝固。

hPSCs接种与培养：

将hPSCs接种在包被Matrigel的培养板中，并使用特定的培养基进行培养。

当细胞融合度达到约75~85%时，进行解离并重新接种。

内胚层分化：

使用特定的分化培养基，将hPSCs逐步分化为内胚层细胞。

中肠和后肠分化：

在内胚层分化的基础上，使用特定的分化培养基进一步诱导中肠和后肠的分化。

类器官形成与培养：

在显微镜下观察并收集形成的3D结构（即球状体），并将其接种在含有特定生长因子的肠基质胶中。

将混合物接种在培养板中，并放入培养箱中进行培养。

每隔一段时间更换肠道生长培养基，以促进类器官的生长和分化。

四、注意事项

无菌操作：

在整个培养过程中，需要严格遵守无菌操作规范，以避免污染。

培养基与生长因子的选择：

根据不同的细胞来源和分化阶段，选择合适的培养基和生长因子。

传代与冷冻保存：

当类器官生长到一定大小时，需要进行传代以维持其生长活性。同时，也可以将部分类器官进行冷冻保存以备后续使用。

观察与记录：

在培养过程中，需要定期观察类器官的生长情况和形态变化，并记录相关数据以供后续分析。

总结，肠道类器官的培养方法多种多样，可以根据具体的实验需求和细胞来源选择合适的方法。同时，在培养过程中需要注意无菌操作、培养基与生长因子的选择以及传代与冷冻保存等关键步骤。