肠道类器官培养是一种模拟体内肠道环境，在体外培养肠道干细胞和多能干细胞以形成具有肠道结构和功能的类器官的技术。以下是肠道类器官培养的基本方法：

一、材料准备

1.组织来源：通常来源于人类小肠和结肠的生物组织，这些组织可以是健康的，也可以是肿瘤组织，但必须确保合规性。

2.试剂与培养基：

70%（V/V）乙醇：用于消毒和清洁。

AdvDMEM+++（或其他适用的培养基）：用于细胞培养。

Primocin（原代细胞抗生素）：用于防止细菌感染。

胶原酶2、Y-27632 RhoⅡ型激酶抑制剂等：用于组织消化和细胞分离。

BME（基质胶/基底膜）：为类器官提供支撑和营养。

红细胞裂解液：用于去除红细胞。

扩增培养基（含Wnt-3a、Rspo-1、Noggin、EGF等生长因子）：用于促进类器官的生长和分化。

3.耗材：

离心管（15ml和50ml）、培养皿（10cm）、手术刀、封口膜、摇床、细胞过滤器（100μm）、移液管（5ml）、24孔板等。

二、培养步骤

4.1.组织处理：

将组织保存在含有AdvDMEM+++和Primocin的50ml离心管中，4℃保存直至使用。

在生物安全柜中，将工作区除菌，并处理相关器材。

将组织转移到培养皿中，并用手术刀切成1立方毫米左右的小块状。

2.组织消化：

添加消化培养基（含胶原酶等）并用移液管吹打混匀。

将组织转移到离心管中，用培养基冲洗培养皿以确保组织全部进入离心管。

盖上离心管盖子，用封口膜封住，置于摇床上进行消化。

3.细胞分离与重悬：

采用细胞过滤器过滤细胞，并用注射器推杆帮助细胞通过滤网。

离心后弃去上清液，用AdvDMEM+++冲洗细胞并再次离心。

最后一次将细胞用BME重悬。

4.类器官形成：

将适量细胞BME混合液添加在预热的24孔板中。

将24孔板倒置在37℃，5%CO2细胞培养箱中，使液滴凝固。

小心地在每孔添加扩增培养基和RhoKi。

持续观察类器官生长状态。

5.传代培养：

去除类器官培养基，用预冷AdvDMEM+++冲洗类器官并破坏BME液滴。

收集类器官并转移到新的离心管中进行离心。

用BME重悬类器官并重新接种在预热的培养基中。

置于培养箱中继续培养，并定期更换培养基。

三、注意事项

1.无菌操作：整个培养过程必须在无菌条件下进行，以防止细菌和其他微生物的污染。

2.温度控制：细胞培养箱的温度应保持在37℃，以模拟体内环境。

3.CO2浓度：细胞培养箱中的CO2浓度应保持在5%，以维持细胞的正常生长和分化。

4.定期观察：应定期观察类器官的生长状态，及时发现并处理污染或异常情况。

5.质量控制：对类器官进行质量控制，包括生长活力评估、细胞悬液数量评估、单细胞悬液活力评估以及免疫学标记物的表达评估等。

通过以上步骤，可以在体外成功培养出具有肠道结构和功能的类器官，为肠道疾病的研究和治疗提供有力的工具。